內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白提取試劑盒 常備現(xiàn)貨

NobleRyder  EX9048 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白提取試劑盒

產(chǎn)品貨號：EX9048

產(chǎn)品名稱：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白提取試劑盒

產(chǎn)品規(guī)格：50T / 100T

產(chǎn)品簡介：

中文名稱：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白提取試劑盒

規(guī)格：50T ; 100T

儲存條件：2-8℃，1 year

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準(zhǔn)

NobleRyder  EX9048 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白提取試劑盒產(chǎn)品介紹

適用樣本：動物細胞/組織

產(chǎn)品介紹

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)存在于除哺乳動物成熟的紅細胞外的各種真核細胞中。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為由生物膜構(gòu)成的互相通連的片層隙狀或小管狀系統(tǒng)，膜片間的隙狀空間稱為池，通常與細胞外隙和細胞漿基質(zhì)之間不直接相通。這種細胞內(nèi)的膜性管道系統(tǒng)一方面構(gòu)成細胞內(nèi)物質(zhì)運輸?shù)耐?，另方面為細胞?nèi)各種各樣的酶反應(yīng)提供廣闊的反應(yīng)面積。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能與蛋白質(zhì)的合成、糖類和脂類 的合成、解毒、同化作用有關(guān)，并且還具有運輸?shù)鞍踪|(zhì)的功能。 

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白提取試劑盒可用于各種動物細胞和實體軟、硬組織樣本的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白的提取。 

本試劑盒提取的蛋白可用于 Western Blotting、蛋白質(zhì)電泳、免疫沉淀、ELISA、轉(zhuǎn)錄活性分析、Gel shift 凝膠阻滯實驗、酶活性測定等下游蛋白研究實驗。 

本試劑盒提取的蛋白為具有天然蛋白構(gòu)象的活性蛋白。 

本試劑盒中不含有 EDTA，與金屬螯和層析等下游應(yīng)用兼容。

產(chǎn)品特點：

1. 使用方便，從細胞，組織中提取蛋白不需經(jīng)過研磨、反復(fù)凍融、超聲破碎等前處理。

2. 提取過程簡單方便，將蛋白提取的時間縮短至 30 分鐘-1 小時。

3. 含蛋白穩(wěn)定劑，提取的蛋白穩(wěn)定。

4. 紫外檢測蛋白濃度時，背景干擾低。

5. 總蛋白提取液含多種有效成分，可以充分釋放胞漿蛋白、核蛋白和膜蛋白，又可結(jié)合釋出的蛋白防止沉淀。

6. 蛋白酶抑制劑抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制劑配方優(yōu)化。蛋白酶抑制劑混合物包含 6種獨立的蛋白酶抑制劑 AEBSF、Aprotinin、Leupeptin、Pepstatin A、Bestatin、E-64，每 一種抑制劑可特異性抑制某一種或幾種蛋白酶活性。該混合物優(yōu)化的組成使其可以抑制 幾乎所有重要的蛋白酶活性，包括絲an酸蛋白酶、半胱an酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、 丙氨酰-氨基肽酶等。

自備試劑和儀器：

離心機、振蕩器、勻漿機/勻漿器、渦旋混勻器、移液器、冰箱、冰盒，PBS 緩沖液、蛋白定量試劑盒，離心管、吸頭、一次性手套

使用方法：

一、使用注意事項：

1. 旋帽離心管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體甩至管底，避免開蓋時液體灑落。

2. 實驗過程中的所有試劑須預(yù)冷；所有器具須放-20℃冰箱預(yù)冷。整個過程須保持樣品處于低溫。

3. 最好使用標(biāo)準(zhǔn)Dounce勻漿器勻漿，如果沒有Dounce勻漿器，也可用普通玻璃勻漿器勻漿， 但是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白回收率會下降。要求離心力50000×g的離心，沒有條件的話可以采用 30000×g-50000×g離心力，最好能達到45000×g左右。最小離心力需要保證30000×g。

4. 如果需要回收所有光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)小泡，最后一個離心步驟的離心力需要提高到100000×g 力。

5. 離心機轉(zhuǎn)速有相對離心力（RCF，×g）和每分鐘轉(zhuǎn)速（RPM）兩種表示方式，有些離心 機設(shè)置有RPM和×g顯示切換，但部分離心機沒有自動切換功能。需要用下面的公式進行 換算：g=r×1.118×10 -5×rpm2（r為有效離心半徑，即從離心機軸心到離心收集管底部中 心位置的長度，單位為厘米) 例如:轉(zhuǎn)速為3000rpm，有效離心半徑為10 cm，則相對離心力（RCF，×g）為 =10×1.118×10 -5×3000 2=1006.2（×g）。

二、操作步驟

細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白提?。?

1. 提取液制備： 每200μl冷的蛋白提取液C中加入2μl蛋白酶抑制劑混合物，混勻后置冰上備用。

【注】：

1) 根據(jù)需要處理的樣品數(shù)量準(zhǔn)備蛋白提取液，蛋白酶抑制劑混合物不可以一次全部加入 提取液。

2) 加過蛋白酶抑制劑的提取液一周內(nèi)未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制劑。

3) 以下步驟中使用的蛋白提取液為此步配制好的含蛋白酶抑制劑的提取液。

2. 取1-2×10 7個細胞，在4℃，500×g條件下離心2-3分鐘，小心吸取培養(yǎng)基，盡可能吸干， 收集細胞；

3. 用冷PBS洗滌兩次，每次洗滌后盡可能吸干上清。

4. 加入500μl冷的試劑A，置冰上10分鐘。

5. 用Dounce勻漿器勻漿充分勻漿。

【注】：

1) 先用Dounce勻漿器的松型槌初步勻漿10-20次，再用緊型槌勻漿20-30次。

2) 每上下一個來回為一次。

6. 勻漿液在4℃，1000×g力條件下離心5分鐘。棄沉淀，取上清。

7. 將上清在4℃，11000×g力條件下離心10分鐘。棄沉淀，取上清。

8. 將上清在4℃，50000×g力條件下離心45分鐘。棄上清，留沉淀。

【注】：

1) 離心時液體量少可以添加PBS。

2) 沒有高速離心的條件時，可以選擇低速離心法內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白提取試劑盒（EX2690）。

3) 如果期望回收所有光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)小泡，離心力需要提高到100000×g力。

9. 在沉淀中加入400μl冷的試劑B，混勻。

10. 在4℃，50000×g力條件下離心45分鐘。棄上清，留沉淀。

【注】：

1) 離心時液體量少可以添加PBS。

2) 沒有高速離心的條件時，可以選擇低速離心法內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白提取試劑盒（EX2690）。

3) 如果期望回收所有光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)小泡，離心力需要提高到100000×g力。

11. 沉淀中加入100-200μl蛋白提取液C，充分混勻。

12. 在4℃條件下振蕩20-30分鐘。

【注】：

1) 用振蕩器/搖床的較低轉(zhuǎn)速，保持液體晃動即可。

2) 沒有振蕩器時，可以靜置，中間每隔幾分鐘用移液器吹打混勻，稍微延長處理時間。

13. 即得到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白樣品，置冰箱備用或直接用于下游實驗。

【注】：

1) 建議用BCA法進行蛋白定量。

2) 蛋白樣品-80℃存放一年沒有問題。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被細菌污染。

組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白提取：

1.    提取液制備：

每200μl冷的蛋白提取液C中加入2μl蛋白酶抑制劑混合物，混勻后置冰上備用。

【注】：

1) 根據(jù)需要處理的樣品數(shù)量準(zhǔn)備蛋白提取液，蛋白酶抑制劑混合物不可以一次全部加入提取液。

2) 加過蛋白酶抑制劑的提取液一周內(nèi)未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制劑。

3) 以下步驟中使用的蛋白提取液為此步配制好的含蛋白酶抑制劑的提取液。

2. 取50-100 mg新鮮動物組織樣本，用PBS洗滌干凈。

3. 用剪刀盡可能剪碎，用冷PBS洗滌兩次。

4. 加入500μl冷的試劑A，置冰上10分鐘。

5. 用Dounce勻漿器充分勻漿30-40下，至無明顯固體團塊。

【注】：

1) 先用Dounce勻漿器的松型槌初步勻漿10-20次，再用緊型槌勻漿20-30次。

2) 每上下一個來回為一次。

6. 將勻漿液在4℃，1000×g力條件下離心5分鐘。棄沉淀，取上清。

7. 將上清在4℃，11000×g力條件下離心10分鐘。棄沉淀，取上清。

8. 將上清在4℃，50000×g力條件下離心45分鐘。棄上清，留沉淀。

【注】：

1) 離心時液體量少可以添加PBS。

2) 沒有高速離心的條件時，可以選擇低速離心法內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白提取試劑盒（EX2690）。

3) 如果期望回收所有光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)小泡，離心力需要提高到100000×g力。

9. 在沉淀中加入400μl冷的試劑B，混勻。

10. 在4℃，50000×g力條件下離心45分鐘。棄上清，留沉淀。

【注】：

1) 離心時液體量少可以添加PBS。

2) 沒有高速離心的條件時，可以選擇低速離心法內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白提取試劑盒。

3) 如果期望回收所有光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)小泡，離心力需要提高到100000×g力。

11. 沉淀中加入100-200μl蛋白提取液C，充分混勻。

12. 在4℃條件下振蕩20-30分鐘。

【注】：

1) 用振蕩器/搖床的較低轉(zhuǎn)速，保持液體晃動即可。

2) 沒有振蕩器時，可以靜置，中間每隔幾分鐘用移液器吹打混勻，稍微延長處理時間。

13. 即得到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白樣品，置冰箱備用或直接用于下游實驗。

【注】：

1) 建議用BCA法進行蛋白定量。

2) 蛋白樣品-80℃存放一年沒有問題。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被細菌污染。

注意事項：

1. 正式實驗前請選取幾個樣本做預(yù)實驗，以優(yōu)化實驗條件，取得優(yōu)良實驗效果。

2. 螺旋蓋微量試劑管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋和管內(nèi)壁上的液體離心至管底，避免開蓋時試劑損失。

3. 禁止與其他品牌的試劑混用，否則會影響使用效果。

4. 樣品或試劑被細菌或真菌污染或試劑交叉污染可能會導(dǎo)致錯誤的結(jié)果。

5. 最好使用一次性吸頭、管、瓶或玻璃器皿，可重復(fù)使用的玻璃器皿必須在使用前清洗并che底清除殘留清潔劑。

6. 實驗后完成后所有樣品及接觸過的器皿應(yīng)按照規(guī)定程序處理。

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