諾博萊德 總蛋白提取試劑盒（無去垢劑）

總蛋白提取試劑盒（無去垢劑）常備現(xiàn)貨

產品貨號：P4902

產品名稱：總蛋白提取試劑盒（無去垢劑）

產品規(guī)格：50T/100T

產品簡介：

中文名稱：總蛋白提取試劑盒（無去垢劑）

規(guī)格：100T ; 50T

儲存條件：2-8℃，1 year

具體產品的參數(shù)以收到產品說明書的參數(shù)為準

NobleRyder P4902 總蛋白提取試劑盒（無去垢劑）

適用樣本：動物細胞/組織

使用前請注意：

1. 蛋白酶抑制劑未開蓋使用前也可以2-8℃儲存。開蓋使用后-20℃儲存。

2. 蛋白酶抑制劑在2-8℃低溫時是固體狀態(tài)，從冰箱取出后恢復至室溫或37℃短時間水浴，變成液體狀態(tài)后離心至管底部再開蓋。

3. 試劑拆封后請盡快使用完！

產品介紹：

總蛋白提取試劑盒提供全套試劑，適用于從各種原代或傳代培養(yǎng)物細胞和各種動物實體組織，如腦、脊髓、神經結或纖維、脂肪、肝臟、消化道、腎臟、心臟、肌肉、血管、結締組織等動物組織樣品中提取總蛋白。配合其他試劑時，也可以用于植物、細菌、真菌、酵母等樣品的總蛋白提取。

本試劑盒含有的du特配方能夠有效溶解細胞膜組份，包括細胞質膜、核膜和各種細胞器膜。本試劑盒含有的蛋白酶抑制劑混合物，阻止了蛋白酶對蛋白的降解，為提取高純度的蛋白提供了保證。

本試劑盒提取的蛋白可用于Western Blotting、蛋白質電泳、ELISA、轉錄活性分析、Gel shift 凝膠阻滯實驗、免疫共沉淀、酶活性測定等蛋白研究。

本試劑盒的所有組份均不含去垢劑成分，最后得到的蛋白樣品的成分對NI柱純化、分子篩、離子交換、親和純化等下游應用沒有去垢劑影響。

本試劑盒的蛋白提取組份中不含有不可透析除去的去垢劑組份，不含SDS、Triton X-100、chaps等可能影響質譜實驗的組份，最后得到的蛋白質樣品經過透析或者脫鹽處理后將不含有去垢劑、高濃度鹽等影響，基本可以滿足下游任意的蛋白質組學相關實驗研究。

本試劑盒提取的蛋白為具有天然蛋白構象的活性蛋白，下游應用范圍廣，提取液裂解細胞的能力較溫和，需要根據實際樣本情況優(yōu)化裂解時間。

本試劑盒不含有EDTA，與金屬螯合層析等下游應用兼容。

本試劑盒提取得蛋白樣本含有高濃度得鹽成分，不可直接用于2D電泳，將最后樣品脫鹽后用于2D電泳。

本試劑盒按每個處理樣本50mg細胞/組織計（大約50μL細胞沉淀體積），如果需要處理大量的細胞/組織，將提取液按細胞體積的1：10加入細胞沉淀即可。每個50T試劑盒大約可以提取2.5g細胞/組織樣本的總蛋白。根據不同的細胞類型，100mg細胞沉淀物（107個細胞）的總蛋白質產量大約為6mg左右。

適用樣本：

細胞、組織。

自備試劑和儀器：

離心機、振蕩器、渦旋混勻器、勻漿機/勻漿器、移液器、冰箱、冰盒，PBS緩沖液、蛋白定量試劑盒，離心管、吸頭、一次性手套

產品特點：

1. 使用方便，從細胞、組織中提取蛋白不需經過研磨、反復凍融、超聲破碎等前處理。

2. 將蛋白提取的時間縮短至30min-1h。

3. 含蛋白穩(wěn)定劑，提取的蛋白穩(wěn)定。

4. 紫外檢測蛋白濃度時，背景干擾低。

5. 蛋白提取液含多種有效成分，可以充分釋放胞漿蛋白、核蛋白，又可結合釋出的蛋白防止沉淀。

6. 蛋白酶抑制劑抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制劑配方優(yōu)化。蛋白酶抑制劑混合物包含6種獨立的蛋白酶抑制劑AEBSF、Aprotinin、Leupeptin、Pepstatin A、Bestatin、E-64，每一種抑制劑可特異性抑制某一種或幾種蛋白酶活性。該混合物優(yōu)化的組成使其可以抑制幾乎所有重要的蛋白酶活性，包括絲an酸蛋白酶、半胱an酸蛋白酶、天冬an酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

操作步驟：

一、使用注意事項

1. 旋帽離心管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內壁上的液體甩至管底，避免開蓋時液體灑落。

2. 實驗過程中的所有試劑須預冷；所有器具須放-20℃冰箱預冷。整個過程須保持樣品處于低溫。

3. 蛋白酶抑制劑儲存期間溶液如果出現(xiàn)沉淀，不影響使用，溶解后正常使用。

4. 如果試劑盒不能短時間內用完，蛋白酶抑制劑混合物不可以一次全部加入提取液。

5. 可以根據自己實驗需要加入其它蛋白酶抑制劑單品。

6. 下游實驗如果是進行特定蛋白酶或磷酸酶的酶活性檢測，提取液可以不加蛋白酶抑制劑或磷酸酶抑制劑，注意提取過程保持低溫操作，縮短離心時間。

7. Western實驗內參可以選用beta-actin、GAPDH、Tubulin。

8. 蛋白酶抑制劑在2-8℃時是固體狀態(tài)，從冰箱取出后恢復至室溫或37℃短時間水浴，變成液體狀態(tài)后離心至管底部再開蓋。

二、細胞樣本總蛋白提取

懸浮細胞蛋白提取

1. 提取液準備：

2. 每500μL冷的蛋白提取液中加入2μL蛋白酶抑制劑混合物，充分混勻后置冰上備用。

【注】：

(1) 根據需要處理樣本數(shù)量準備蛋白提取液，蛋白酶抑制劑混合物不可以一次性全部加入提取液。磷酸酶抑制劑可以一次加入。

(2) 加入蛋白酶抑制劑的提取液一周內未使用wan全，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制劑。

(3) 下游實驗如果是進行特定蛋白酶或磷酸酶的酶活性檢測，注意根據實際情況調整抑制劑混合物是否加入。

(4) 以下步驟中使用的蛋白提取液為此步配制好的含蛋白酶抑制劑的提取液。

3. 取5×106個細胞，在4℃，2500×g條件下離心5min，小心吸取培養(yǎng)基，盡可能吸干，收集細胞。

【注】：

(1) 細胞數(shù)量根據實驗情況調整，每次的裂解液用量并不是一定的，請根據實際情況調整。

(2) 一般按細胞壓積的10倍左右加入裂解液即可。如果需要提高得到的蛋白樣品濃度，可以將細胞：提取液用量比例調整為1：5。

4. 用冷PBS洗滌細胞兩次，每次洗滌后盡可能吸干上清。（加入PBS混勻，2500×g離心5min）

5. 每5×106-1×107個細胞（大約50mg細胞/50μL細胞沉淀體積）中加入500μL冷的總蛋白提取液，吹打混勻后，在4℃條件下振蕩20-30min，至細胞充分裂解，無明顯細胞沉淀。

【注】：

(1) 使用振蕩器/搖床的較低轉速，提取液能輕微晃動即可。

(2) 沒有震蕩條件也可以不振蕩，稍微延長提取液處理的時間，中間每隔幾分鐘用移液器吹打均勻即可。

6. 在4℃，12000×g條件下離心15min。

7. 將上清吸入另一預冷的干凈離心管，即可得到總蛋白。

8. 將上述蛋白提取物定量后分裝于-80℃冰箱保存?zhèn)溆没蛑苯佑糜谙掠螌嶒灐?/span>

【注】：

(1)   建議用BCA法進行蛋白定量。

(2) 蛋白樣品在-80℃存放一年沒有問題。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被細菌污染。

9. 將蛋白樣品透析處理或者脫鹽柱脫鹽處理后用于下游實驗。

【注】：

(1) 蛋白樣品中含有鹽，需要脫鹽處理后用于雙向電泳。

(2) 經透析或脫鹽離心柱處理的蛋白樣品不含有去垢劑和高濃度鹽。

貼壁細胞蛋白提取

1. 提取液準備：

2. 每500μL冷的蛋白提取液中加入2μL蛋白酶抑制劑混合物，充分混勻后置冰上備用。

【注】：

(1) 根據需要處理樣本數(shù)量準備蛋白提取液，蛋白酶抑制劑混合物不可以一次性全部加入提取液。磷酸酶抑制劑可以一次加入。

(2) 加入蛋白酶抑制劑的提取液一周內未使用wan全，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制劑。

(3) 下游實驗如果是進行特定蛋白酶或磷酸酶的酶活性檢測，注意根據實際情況調整抑制劑混合物是否加入。

(4) 以下步驟中使用的蛋白提取液為此步配制好的含蛋白酶抑制劑的提取液。

3. 小心吸取貼壁細胞的培養(yǎng)液。

4. 用冷PBS洗滌細胞兩次，每次洗滌后盡可能吸干PBS。（加入PBS混勻，2500×g離心5min）

5. 加入適量冷的總蛋白提取液，振蕩15-30min，至細胞充分裂解，用細胞刮刀刮一遍，將裂解液吸入另一干凈離心管。

【注】：

(1) 推薦裂解液使用量：60mm培養(yǎng)皿250μL-500μL；100mm培養(yǎng)皿500μL-1mL；6孔板200μL -250μL/孔；24孔板100μL/孔；96孔板50μL/孔；75cm2培養(yǎng)瓶500μL-1mL。

(2) 也可用細胞刮刀刮下細胞或者用yi酶將細胞消化下來后按懸浮細胞操作步驟進行。

6. 在4℃，12000×g條件下離心15min。

7. 將上清吸入另一個預冷的干凈離心管，即可得到總蛋白。

8. 將上述蛋白提取物定量后分裝于-80℃冰箱保存?zhèn)溆没蛑苯佑糜谙掠螌嶒灐?/span>

【注】：

(1) 建議用BCA法進行蛋白定量。

(2) 蛋白樣品在-80℃存放一年沒有問題。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被細菌污染。

9. 將蛋白樣品透析處理或者脫鹽柱脫鹽處理后用于下游實驗。

【注】：

(1) 蛋白樣品中含有鹽，需要脫鹽處理后用于雙向電泳。

(2) 經透析或脫鹽離心柱處理的蛋白樣品不含有去垢劑和高濃度鹽。

三、組織樣本總蛋白提取

1. 提取液準備：

每500μL冷的蛋白提取液中加入2μL蛋白酶抑制劑混合物，充分混勻后置冰上備用。

【注】：

(1) 根據需要處理樣本量準備蛋白提取液，蛋白酶抑制劑混合物不可以一次性全部加入提取液。磷酸酶抑制劑可以一次加入。

(2) 加入蛋白酶抑制劑的提取液一周內未使用wan全，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制劑。

(3) 下游實驗如果是進行特定蛋白酶或磷酸酶的酶活性檢測，注意根據實際情況調整抑制劑混合物是否加入。

(4) 以下步驟中使用的蛋白提取液為此步配制好的含蛋白酶抑制劑的提取液。

2. 取50-100mg組織樣本，用PBS洗干凈，然后用手術jian刀盡可能剪碎，加入500μL總蛋白提取液，用組織勻漿器/勻漿機勻漿至無明顯肉眼可見固體。

【注】：

(1)   如果組織樣品很細小，可以剪碎后直接加入提取液振蕩15min，可以不用勻漿器。

(2)   一般按組織：提取液用量1：10（w/v）左右加入提取液即可。如果需要提高得到的蛋白樣品濃度，可以將組織：提取液用量比例調整為1：5。

(3)   也可用液氮研磨的方法，采用常規(guī)的液氮研磨方法即可。

3. 將組織勻漿吸入一預冷的干凈離心管中，在4℃條件下振蕩10-20min。

【注】：

(1) 使用振蕩器/搖床的較低轉速，提取液能輕微晃動即可。

(2) 沒有振蕩條件也可以不振蕩，稍微延長提取液的處理時間，中間每隔幾分鐘用移液器吹打混勻即可。

4. 在4℃，10000-14000×g條件下離心15min。

5. 將上清吸入另一個預冷的干凈離心管，即可得到總蛋白。

6. 將上述蛋白提取物定量后分裝于-80℃冰箱保存?zhèn)溆没蛑苯佑糜谙掠螌嶒灐?/span>

【注】：

(1) 建議用BCA法進行蛋白定量。

(2) 蛋白樣品在-80℃存放一年沒有問題。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被細菌污染。

7. 將蛋白樣品透析處理或者脫鹽柱脫鹽處理后用于下游實驗。

【注】：

(1) 蛋白樣品中含有鹽，需要脫鹽處理后用于雙向電泳。

(2) 經透析或脫鹽離心柱處理的蛋白樣品不含有去垢劑和高濃度鹽。

常見問題分析：

1. 蛋白濃度低？

處理部分組織樣本時可能沒有裂解wan全，導致蛋白濃度低。只要適當增加試劑A的處理時間即可。最好在持續(xù)振蕩的條件下處理，沒有振蕩器也可間隔幾分鐘用吸頭吹打混勻。

2. 用什么方法定量蛋白？

建議用BCA法。不適合用Bradford法，因為試劑A中含有干擾Bradford法的組份，導致定量不準。如果已經進行過透析處理或者用脫鹽柱改換過緩沖體系，則可以用Bradford法定量。

3. 提取的蛋白具有活性嗎？

本試劑盒不含有離子型去垢劑組份，不破壞蛋白的結構，沒有對蛋白質之間原有的相互作用的破壞，蛋白均保持其天然構象和活性。

4. 細胞裂解速度慢？

為了充分保證提取得到的蛋白的活性，提取液采用du特的保護蛋白的配方，裂解能力溫和，下游應用范圍廣。適當延長裂解的時間即可。

5. 提取時出現(xiàn)膠狀沉淀？

蛋白提取液處理產物中有時會出現(xiàn)少量透明膠狀物，屬正常現(xiàn)象。該透明膠狀物為含有基因組DNA等的復合物。不檢測和基因組DNA結合特別緊密的特定蛋白的情況下，可以直接離心取上清進行后續(xù)實驗即可；如果需要檢測和基因組結合特別緊密的蛋白，則可以通過超聲處理，300w/10s間隔10s，超聲3min，隨后離心取上清用于后續(xù)實驗。檢測一些常見的轉錄因子，例如NF-kappaB、p53等時，不必進行超聲處理。

注意事項：

1. 正式實驗前請選取幾個樣本做預實驗，以優(yōu)化實驗條件，取得優(yōu)良實驗效果。

2. 螺旋蓋微量試劑管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋和管內壁上的液體離心至管底，避免開蓋時試劑損失。

3. 禁止與其他品牌的試劑混用，否則會影響使用效果。

4. 樣品或試劑被細菌或真菌污染或試劑交叉污染可能會導致錯誤的結果。

5. 最好使用一次性吸頭、管、瓶或玻璃器皿，可重復使用的玻璃器皿必須在使用前清洗并che底清除殘留清潔劑。

6. 實驗完成后所有樣品及接觸過的器皿應按照規(guī)定程序處理。

總蛋白提取試劑盒（無去垢劑）常備現(xiàn)貨

產品訂購信息：

P4902  總蛋白提取試劑盒（無去垢劑）  50T/100T