One Step Gibson Cloning Kit

(可連接1-5個片段)

OneStepGibsonCloningKit   無縫克隆 

 目錄號：42112

包 裝 量：

產(chǎn)品儲存：-20°C保存，避免反復凍融

制品說明：本制品不依賴于T4連接酶，不受載體和目的片段的酶切位點限制，而直接用重疊片段重組的方法，采用特殊的酶組合可以將任意方法線性化后的載體和與其兩端具有15-25bp重疊區(qū)域的PCR片段（平端）定向重組，可以快速實現(xiàn)1-5個片段的高效無縫克隆。

產(chǎn)品特點：

1. 30分鐘可以將一個或者多個長、短PCR擴增片段（平端）插入載體。

2. 不受載體和插入片段酶切位點的可用性和載體平端/粘性末端的限制，可以在任意位點進行克隆。

3. 無縫克隆，插入點不會引入不需要的堿基序列。

4. 高效、準確，陽性率＞95% 。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準

線性化載體和插入DNA片段的制備：

A：線性化載體的制備

 (1). 酶切來源：酶切所得線性載體，平末端或者粘端、單酶切或者雙酶切均可，酶切后膠回收。

注： 無縫拼接和克隆反應體系內無雙鏈DNA連接酶，不會發(fā)生載體自連反應。因此，即使是以單酶切方式制備的線性化載體也無需進行末端脫磷酸處理。重組產(chǎn)物轉化后出現(xiàn)的假陽性克隆 (無插入片段) 是由酶切不wan全未線性化環(huán)狀載體轉化而形成的。我們推薦酶切后膠回收可以把這種未線性化載體比例降低到zui低程度。

(2). 反向PCR來源：建議使用高保真DNA聚合酶（貨號：P517-05）制備，如果擴增條帶單一可以通過PCR產(chǎn)物純化（貨號：DC012-100）獲得載體，否則通過膠回收（貨號：DC011-100)獲得載體。

注：反向PCR的質粒模板也是非線性化載體，也可能導致假陽性克隆（無插入片段），因此PCR來源線性載體（PCR產(chǎn)物）純化前用Dpn I內切酶消化質粒模板，可以降低背景，提高陽性率。但是一般情況下，經(jīng)過膠回收已經(jīng)足以把這種未線性化載體比例降低到zui低，因此反向PCR來源的線性化載體我們也推薦膠回收。

B：插入DNA片段的制備

(1). 單個插入片段克隆引物設計：克隆引物包括插入片段特異性引物序列和重疊序列。

克隆正向引物(5’-3’)：線性載體正向16-25 nt重疊區(qū)序列(3’末端算起)+插入片段正向特異引物序列（18-25 nt）

克隆反向引物(5’-3’)：線性載體反向16-25 nt重疊區(qū)序列(3’末端算起)+插入片段反向特異引物序列（18-25 nt）

注意：重疊區(qū)的堿基數(shù)至少16 bp，并且多段重疊區(qū)域之間的Tm值需保持一致且﹥60°C (AT pair = 2°C and GC pair = 4°C)，否則可延長堿基數(shù)目直到符合要求。

按照線性載體末端的結構（5’突出，3’突出，平末端），引物設計也分3種情況，示意如下：

線性化載體的兩端因線性方式（如單酶切、雙酶切、反向PCR）不同，可以是以上三種末端結構的兩兩任意組合，插入片段特異性引物設計的原則遵循一般引物設計的原則即可。

計算擴增引物退火溫度時，只需計算基因特異性擴增序列的Tm值，載體末端同源序列不應參與計算。

正向引物設計舉例說明（EcoR I 酶切開）：

如上圖，載體由Ecor I 酶切開，形成5’突出末端：

根據(jù)上述設計原則，從3’端開始計算，往回算16bp-25bp（本舉例采用了20 bp末端重疊相同序列），加到目的片段特異引物序列前面即可。確保重疊區(qū)域的Tm值保持一致且﹥60°C (AT pair = 2°C and GC pair = 4°C)。

正向引物具體如下：5' — GAGCCTAGGTGAGTTGGCCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN —3'

注意：以上引物設計完成克隆連接后，EcoR I 酶切位點將會消失（不保留酶切位點）。

如果需要保留 EcoR I 酶切位點，需要在載體末端20 bp重疊序列和目的片段特異引物序列之間補齊缺失的EcoR I 識別位點序列aattc，完成克隆連接后，EcoR I 酶切位點依然存在（保留酶切位點）。

具體如下：5' — GAGCCTAGGTGAGTTGGCCG aattc NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN —3'

反向引物設計舉例說明（Hind III 酶切開）：                           

如上圖，載體由Hind III 酶切開，形成5’突出末端：

根據(jù)上述設計原則，從3’端開始計算，往回算16bp-25bp（本舉例采用了20 bp末端重疊相同序列），加到目的片段特異引物序列前面即可。確保重疊區(qū)域的Tm值保持一致且﹥60°C (AT pair = 2°C and GC pair = 4°C)。

反向引物具體如下：5' — CTGCCATCGGATCGTTCGCANNNNNNNNNNNNNNNNNNNN —3'

注意：以上引物設計完成克隆連接后，Hind III 切位點將會消失（不保留酶切位點）。

如果需要保留 Hind III 酶切位點，需要在載體末端20 bp重疊序列和目的片段特異引物序列之間補齊缺失的Hind III 識別位點序列agctt ，Hind III 酶切位點依然存在（保留酶切位點）。

具體如下：5' — CTGCCATCGGATCGTTCGCA agctt NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN —3'

 (2). 多個插入片段的克隆引物設計：與載體兩端連接的插入片段引物設計方法同單片段設計方法，片段與片段之間連接的插入片段引物設計方法見下圖例：

* 多個插入片段之間重疊區(qū)設計有上述*標記(藍色和紅色）的兩種方式，在多片段引物設計時，選擇任意一種方式或者兩種方式混用均可，保證片段與片段之間有15-25bp 的重疊區(qū)。

(3). 酶的選擇：建議使用高保真DNA聚合酶或者PCR Mix（貨號：P517-05或者P814-05）。

(4). 反應條件：一般按照具體使用的聚合酶說明書進行即可。

(5). 純化插入片段

l可選：如果片段來源于質粒模板，且該質粒與重組載體具有相同抗性，純化前用Dpn I內切酶消化質粒模板， 可降低背景，提高陽性率。

l如果片段單一，則建議用PCR產(chǎn)物純化試劑盒（貨號：43012-100）純化片段。

l 如果有非特異擴增，則建議用膠回收試劑盒（貨號：43011-100）回收片段。

l 使用該方法克隆，用來線性化載體的酶切位點在拼接的時候會缺失，如果對酶切位點有嚴格要求的，建議 注意酶切位點的選擇，必要時可在正反向克隆引物的重疊區(qū)序列和特異基因序列之間增加缺失掉的堿基來恢復原有酶切位點（見前述正反向引物設計舉例說明）。

l 如果重組質粒用于蛋白表達，則在引物設計時注意讀碼框，蛋白表達及純化所需序列（如啟動子，RBS序列，起始密碼子，終止密碼子，蛋白標簽等）不被破壞。

無縫克隆反應的操作步驟：

注意：2 × Cloning Master Mix 含有連接增強劑PEG很粘稠，從冰箱拿出來溫度低時更粘稠，可以放在手心化凍幾分鐘提高溫度便可降低粘稠度（不影響質量），手指bo打離心管底充分混勻或者渦旋震蕩混勻。

1. 按照下表建立反應體系（可使用PCR管在室溫配制）

* 載體一般用10-50 ng，插入片段與載體的摩爾比在2:1-3:1之間最佳；如果插入片段小于200bp，插入片段與載體的摩爾比用5:1，多片段連接的情況下，片段與片段之間摩爾比為1:1。

2. 輕輕混勻，在50°C反應15分鐘（可在PCR儀器上進行），反應結束后，將PCR管置冰上后直接轉化或者保存于-20°C。超過3個片段的連接，可以延長反應時間到30分鐘。

3. 取5 μl 反應產(chǎn)物按照感受態(tài)細胞說明書進行轉化（如果轉化子較少，可以將所有的產(chǎn)物轉化并將所有的轉化液涂板）。

陽性克隆的鑒定：

可根據(jù)具體情況，選擇菌落PCR鑒定，提取質粒（貨號31011-100）進行限制性內切酶鑒定或測序鑒定。

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