果糖 1,6-二磷酸醛縮酶（Fructose 1,6 bisphosphate aldolase，FDA）試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法 100T/96S

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

植物葉綠體中果糖 1,6-二磷酸醛縮酶是光合作用中參與calvin 循環(huán)的重要酶。催化果糖 1,6-二磷酸和景天庚酮糖 1,7-二磷酸的合成反應(yīng)，在各種逆境脅迫下表現(xiàn)不同的響應(yīng)。

測(cè)定原理：

果糖 1,6-二磷酸醛縮酶催化果糖 1,6-二磷酸生成 3-磷酸甘油醛和磷酸二羥丙酮，在磷酸丙糖異構(gòu)酶和 α-磷酸甘油脫氫酶作用下催化 NADH 和磷酸二羥丙酮生成 NAD 和α-磷酸甘油，340nm 處吸光值的變化可反映果糖 1,6-二磷酸醛縮酶活性的高低。

果糖 1,6-二磷酸醛縮酶試劑盒   光合系列

組成：

試劑二：粉劑×1 瓶，-20℃避光保存。臨用前加 2ml 蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑三：粉劑×1 瓶，-20℃避光保存。臨用前加 2 ml 蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑四：粉劑×1 瓶，-20℃避光保存。臨用前加 2 ml 蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑五：液體 2ml×1 瓶，4℃避光保存。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的參數(shù)為準(zhǔn)

自備儀器和用品：

天平、震蕩儀、低溫離心機(jī)、研缽、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板。

酶液提取：

①總FDA 酶提取NADPH 的提取：建議稱取約 0.1g 樣本，加入 1ml 提取液一，冰浴勻漿后超聲破碎（冰浴，200W，破碎 3s，間歇 7s，總時(shí)間 1min），然后 4℃，8000g 離心 10min，取上清測(cè)定。

②胞漿和葉綠體FDA 酶的分離：NADP⁺的提取：按照植物組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5～10

的比例（建議稱取約 0.1g 樣本，加入 1ml 提取液一），冰浴勻漿后于 4℃，200g 離心 5min，棄沉淀，取上清在 4℃，8000g 離心 10min，取上清用于測(cè)定胞漿FDA 酶活性，取沉淀加 1ml 提取液二，震蕩溶解后超聲破碎（冰浴，200W，破碎 3s，間歇 7s，總時(shí)間 1min），然后 4℃，8000g 離心 10min，取上清測(cè)定葉綠體中FDA 酶活性。

建議測(cè)定總FDA 酶活性，按照步驟①提取粗酶液，若需要分別測(cè)定胞漿和葉綠體中的 FDA，則按照步驟

②提取粗酶液。

測(cè)定操作：

1. 紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 取微量石英比色皿/96 孔板，依次加入 100μL 試劑一，20μL 試劑二，20μL 試劑三，20μL 試劑四，20μL試劑五，20μL 粗酶液，充分混勻，記錄 340nm 處 10s 的吸光值A1 和 310s 的吸光值A2，△A=A1-A2

計(jì)算公式:

a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1） 按照樣本蛋白濃度計(jì)算

酶活單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

FDA（nmol/min/mg prot）= ΔA÷（ε×d）×V 反總÷(V 樣×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr

（2） 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活單位定義：每克組織每分消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

FDA（nmol/min/g 鮮重）= ΔA÷（ε×d）×V 反總÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T=321.54×ΔA÷W

（3） 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活單位定義：每 10⁴ 個(gè)細(xì)胞每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

FDA（nmol/min/10⁴ cell）= ΔA÷（ε×d）×V 反總÷(V 樣×細(xì)胞數(shù)量÷V 樣總) ÷T

= 321.54×ΔA÷細(xì)胞數(shù)量

（4） 按照液體體積計(jì)算

酶活單位定義：每毫升液體每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

FDA（nmol/min/ml）= ΔA÷（ε×d）×V 反總÷V 樣÷T=321.54×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.2ml；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L/mol /cm；d：比色皿光徑，1cm； V 樣：加入樣本體積，0.02ml；V 樣總：加入提取液體積，1ml；T：反應(yīng)時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g

b. 用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1） 按照樣本蛋白濃度計(jì)算

酶活單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

FDA（nmol/min/mg prot）= ΔA÷（ε×d）×V 反總÷(V 樣×Cpr) ÷T= 643.08×ΔA÷Cpr

（2） 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活單位定義：每克組織每分消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

FDA（nmol/min/g 鮮重）= ΔA÷（ε×d）×V 反總÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T= 643.08×ΔA÷W

（3） 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活單位定義：每 10⁴ 個(gè)細(xì)胞每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

FDA（nmol/min/10⁴ cell）= ΔA÷（ε×d）×V 反總÷(V 樣×細(xì)胞數(shù)量÷V 樣總) ÷T

= 643.08×ΔA÷細(xì)胞數(shù)量

（4） 按照液體體積計(jì)算

酶活單位定義：每毫升液體每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

FDA（nmol/min/ml）= ΔA÷（ε×d）×V 反總÷V 樣÷T= 643.08×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.2ml；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，0.5cm； V 樣：加入樣本體積，0.02ml；V 樣總：加入提取液體積，1ml；T：反應(yīng)時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g

果糖 1,6-二磷酸醛縮酶試劑盒   光合系列