Script III miRNA1st Strand cDNA Synthesis Kit（by stem-loop）莖環(huán)法 miRNA 第一連反轉(zhuǎn)錄試劑盒

miRNAFirstStandSynthesisKit 反轉(zhuǎn)錄試劑

目錄號(hào):71505

產(chǎn)品內(nèi)容

保存條件

-20℃保存，有效期 12 個(gè)月。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準(zhǔn)

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

Script III miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit（by stem-loop）采用第三代高效逆轉(zhuǎn)錄酶，具有更強(qiáng)的延伸能力和穩(wěn)定性，并配備了具有DNA分解活性的特殊dsDNase，只需一步操作， 即可同時(shí)完成基因組清除與莖環(huán)法miRNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，操作方便快捷。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以用于后續(xù)的染料法或探針法熒光定量檢測(cè)。此方法特異性高只對(duì)成熟的miRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)，不受其前體干擾，序列高度同源的miRNA也可精確區(qū)分。本試劑盒具有可從20 pg ~ 2 μg的total RNA中高效制備miRNA對(duì)應(yīng)的第一鏈cDNA。

原理：本試劑盒采用莖環(huán)結(jié)構(gòu)的逆轉(zhuǎn)錄引物與 miRNA 分子的3’端 結(jié)合，并在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下進(jìn)行反應(yīng)，獲得人為加長的 miRNA 第一鏈 cDNA。

引物的制備：

需要自己設(shè)計(jì)、合成用于反轉(zhuǎn)錄的頸環(huán)引物！

microRNA莖環(huán)引物及Realtime-PCR引物設(shè)計(jì)方法如下：

1. stem-loop RT引物設(shè)計(jì)：

基于通用的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，只需要按照不同的miRNA序列修改最末端6個(gè)堿基即可。通用莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列為：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC。

例如設(shè)計(jì)miR-1（UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU）的RT引物，只需在通用莖環(huán)序列后加上miRNA3’末端的6個(gè)堿基的反向互補(bǔ)序列，即GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCA CTGGATACGACATACAT。

2. realtime 上游引物設(shè)計(jì)：

miRNA序列除去3’端6個(gè)堿基 的剩余部分作為上游引物，如miR-1的上游引物為(注意 把U改為T)：TGGAATGTAAAGAAGT.檢查引物的Tm 值（一般參考DNAMAN），如果Tm值較低，則在5’端加GC使Tm值接近60度。因此miR-1的上游引物可設(shè)計(jì) 為：GCGCTGGAATGTAAAGAAGT，61.4度。

下游引物是通用的，序列為GTGCAGGGTCCGAGGT。

引物設(shè)計(jì)好后，需要通過預(yù)試驗(yàn)檢測(cè)引物的特異性。一般需要做溶解曲線來檢測(cè)引物的特異性；同時(shí)最好將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)產(chǎn)物是否單一（產(chǎn)物長度很短，需要3%以上的瓊脂糖膠）

操作步驟： (以20 μl反應(yīng)體系為例)

1．莖環(huán)法反轉(zhuǎn)錄體系的配制

使用 RNase-Free PCR 管在冰上配制：(使用前，請(qǐng)將各組分輕彈混勻，點(diǎn)甩離心收集至管底，置冰上備用。)

2．輕柔吸打混勻，點(diǎn)甩離心，置 PCR 儀進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

25℃孵育 5 min 后， 42℃孵育 20 min，85°C 加熱 5 sec，失活 RTase 和 dsDNase，終止反應(yīng)。

3．合成的cDNA反應(yīng)液可放置于-20℃保存，也可以直接進(jìn)行下游PCR或者熒光定量qPCR檢測(cè)。

注意事項(xiàng)：

1. 在反應(yīng)中使用的total RNA 必須含有小分子RNA 。

2. 此過程也可以使用小分子RNA， miRNA無法直接用分光光度計(jì)定量，建議加入量為2μl ~5μl。可根據(jù)目的miRNA豐度決定加入量，但是對(duì)于低豐度miRNA 樣品而言(如血清血漿提取物)，可直接加入最大體積8 μl。

3.  5 × miRT Reaction Mix非常粘稠，溶液容易吸附在管壁和吸頭外導(dǎo)致?lián)p失，用前請(qǐng)點(diǎn)甩離心后使用，并且避免吸頭外壁沾附損失。可以每次按照3.6-3.8μl使用，也不影響使用效果。

按照miRNA熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)P501)進(jìn)行qPCR。

注：按照上述操作步驟得到的cDNA模板用于下游PCR或者熒光定量PCR檢測(cè)時(shí)，可以根據(jù)實(shí)際情況選擇使用量，對(duì)于特殊的檢測(cè)體系中，高含量的cDNA模板易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，可根據(jù)所檢測(cè)miRNA的豐度適當(dāng)?shù)南♂?/span>cDNA（5-10倍或者100倍）后使用。如果發(fā)現(xiàn)有非特異擴(kuò)增條帶，或者融鏈曲線顯示有非特異擴(kuò)增，往往提示cDNA模板過量，可以嘗試將上述cDNA模板稀釋幾十到幾百倍甚至上千倍再使用。

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